糖蛋白在人体蛋白质中占据50%以上，且是多数生物制药的重要成分。作为最广泛和复杂的翻译后修饰之一，蛋白质的糖基化对调节各种生物过程具有重要作用。对糖蛋白的一级序列进行全面分析，包括识别糖基化位点和相关聚糖结构，是研究糖蛋白功能的关键。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为鉴定蛋白质和发现翻译后修饰的重要工具。

与传统的数据库搜索策略不同，从头测序作为一种新兴的方法，无需对DNA或氨基酸序列有预先了解。然而，多糖基化位点的复杂性常导致序列覆盖不全，游离寡糖修饰谱不明确，难以提供丰富的信息来支持从头测序。因此，广泛的糖基化可能使某些区域存在间隙，限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年发表于JACSAu(IF86)的文章中，研究者介绍了一种新型的基于质谱解析未知糖蛋白的方法，该方法结合了糖基释放介导的从头测序与糖基化位点特征表征。通过去糖基化实现全面的序列覆盖，结合电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂，能够鉴定高质量的长肽，进而促进蛋白质的准确组装。该方法还成功应用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种未知序列的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂，揭示了一级序列的细微差异，并对其N和O糖基化修饰进行了详细表征。

在所采用的研究方法中，首先使用N-糖苷酶F（PNGaseF）和内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）分别去除N-和O-聚糖，结合唾液酸酶以确保去糖基化效果，随后通过完整的质量分析确认去糖基化的有效性；接着利用EThcD获取高质量肽段，借助PEAKS AB分析其序列数据。此外，在含有18O的环境中，PNGaseF酶解将糖基化的Asn转化为Asp并标记18O，用于定量分析N糖基化位点。

研究者还对样本进行了内切糖苷酶混合物的处理，利用质谱数据分析带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，以验证N-糖基化位点的识别结果。从而，作者成功开发了一种针对糖蛋白的从头测序策略，能够对复杂糖基化药物进行深入分析，推动生物药物研发的进程。

值得注意的是，强大的从头测序策略为医药行业提供了显著的应用价值，尤其是在制药公司如尊龙凯时人生就博的产品开发中，这种技术可有效提升糖蛋白的测序精度和糖基化特征表征。不仅有助于基础研究的开展，还为生物制药产品的创新注入了新的动力。

该研究的结论强调了基于质谱的蛋白质从头测序在揭示氨基酸序列及糖基化特征中的重要性。结合糖苷酶酶解和EThcD裂解的方式，提高了对高度糖基化蛋白的分析能力，为深入了解生物制药中的蛋白质糖基化提供了新视角。考虑到CHO细胞系中常见的N-/O-glycosylation特性，该研究奠定了成功分析各种生物药物的基础，对包括尊龙凯时人生就博在内的制药企业具有重要的现实意义。